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      保存重组蛋白的原则及方法

      来源:js3333线路检测中心生物   发布时间 :2024-01-30 16:36   点击量:

      分子生物学实验室的同仁们都曾经或多或少地与蛋白质纯化打过交道。在完成蛋白质纯化后 ,我们都面临着如何有效保存的问题 。是否遇到过同批次的蛋白 ,复融后,活性却呈现出一些差异甚至失活 ?蛋白质作为生物大分子,在纯化后如果保存不当,容易发生失活和变性的情况 。因此,接下来我们将深入探讨重组蛋白的妥善保存问题 。

      保存蛋白质应该遵循下面这几个基本原则:

       

      1. 低温

      保存蛋白质时 ,确保在低温条件下至关重要 。低温意味着较低的能量水平,有助于减缓蛋白质分子内部的热运动,减少键的断裂可能性。此外,在低温下,微生物繁殖减缓,潜在的蛋白酶活性降低 ,从而有助于维持蛋白质的活性。

       

      2. 无菌

      在进行蛋白质实验操作时,务必佩戴手套。尽管实验室戴手套通常是为了保护实验者自身,但在生化实验中,蛋白质是我们需要保护的主体。我们皮肤上存在一些蛋白酶,可能会降解蛋白样品。此外,皮肤上的其他化学物质也可能污染蛋白样品 。为了防止细菌生长 ,最好将蛋白质保存在经过灭菌处理的容器中 。

       

      3浓度

      为了提高蛋白质的稳定性,建议以较高浓度保存重组蛋白质 ,最好保持在1mg/ml以上。高浓度有助于防止蛋白质分子附着在塑料或玻璃管壁上。不容忽视的是,疏水性蛋白质容易附着在管壁上。

       

      4. 分装

      蛋白质需要冷冻保存,但在实验中常在室温或更高温度使用。反复冻融过程中产生的冰晶会损害蛋白质的结构和构象。为减少冻融次数,建议将纯化后的蛋白质进行分装保存 ,每次使用前融化所需量,以确保蛋白质样品经历单次冻融。

       

      5. 速冻/速融

      在蛋白质溶冷冻时 ,为了减少蛋白质分子在高盐度或pH条件下的曝露时间,可选择速冻方法。速冻可通过液氮实现。速冻后 ,蛋白质可以存放在-20°C或-80°C中,同样,蛋白质的快速融化也是至关重要的,可在温水中进行。

       

      6. 避免震荡

      震荡产生的剪切力可能对蛋白质造成破坏。在震荡时 ,液体中会生成气泡,导致氧气进入 ,使蛋白质处于氧化环境中。由于蛋白质中的半胱氨酸容易被氧化为胱氨酸 ,这一过程可能破坏蛋白质的活性。

       

      7. 添加剂

      为了确保蛋白质的稳定性 ,需要将其保存在适当的缓冲液中,并添加一些保护剂。例如 ,在-20°C保存时 ,可添加10%-50%的甘油防止结冰,避免冻融过程。此外 ,还可添加防腐剂抑制细菌生长 ,或蛋白酶抑制剂(PMSF)以防止蛋白酶对蛋白质的破坏 。同时,添加一些还原剂如DTT可防止蛋白质氧化。在选择添加剂时 ,务必确保其不会影响蛋白的活性。

       

      蛋白质的保存方法取决于其稳定性以及再次使用的时间。

       

       
       
      长期保存(6个月或更长)
       
       

      对于冻干状态的重组蛋白,由于处于完全脱水的状态 ,在不受潮的情况下可以在冰箱中保存数年 。

      对于复融后的重组蛋白,比较合适的保存方式是分装后保存在 -20°C 或 -80°C,六个月内一般是没有问题的。

       

      (1)分装有助于最大程度减少反复冻融对抗体和重组蛋白活性的损害 ,并减少从同一管中多次吸取可能导致的污染。

       

      (2)分装的量最好按一次实验用完为准,每份至少不能少于10 µl。体积越小,蛋白浓度受蒸发和管壁吸附影响的可能性越大。

       

      (3)复融后的分装重组蛋白如果一次用不完 ,将剩余母液保存在 4℃,避免再冻起来。

       

      (4)蛋白工作液应当在当天配制并当天使用,最好不要在4℃超过1天 。

       

       
       
       
      短期保存(1周内) :
       
       
       

      对于短期保存 ,大多数蛋白质可以在4°C下保存 ,以避免反复冻融对活性的影响。然而,4°C保存面临微生物污染的问题。因此,如果保存时间超过24小时,建议使用0.22微米的滤膜过滤样品 ,然后在无菌管中保存。值得注意的是,并非所有蛋白质都适合在4°C下保存。

      

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